Resumen: Microorganismos extremófilos, en particular arqueas termofílicas que habitan entornos de alta temperatura, muestran una estabilidad proteica extraordinaria gracias a sistemas de chaperonas especializados. Este trabajo propone aprovechar las características estructurales y funcionales de las chaperoninas arqueales de Sulfolobus islandicus para diseñar variantes enzimáticas industriales más estables. Presentamos un marco de optimización multiobjetivo que combina simulaciones de dinámica molecular, análisis de secuencias asistido por inteligencia artificial y evolución dirigida para diseñar variantes de cellulasa (cellobiohydrolase I CBHI) con mayor termoestabilidad y actividad catalítica, con el objetivo de revolucionar la biocatálisis en procesos industriales agresivos, reducir costes y minimizar el impacto ambiental.

Introducción: Las aplicaciones industriales de enzimas se ven frecuentemente limitadas por la inactivación en condiciones exigentes como altas temperaturas, pH extremos y disolventes orgánicos. Mejorar la estabilidad de las enzimas es clave para la viabilidad económica y la sostenibilidad. Las estrategias modernas de ingeniería de proteínas ofrecen rutas prometedoras. Las arqueas termofílicas constituyen una fuente de inspiración por su capacidad de mantener proteínas funcionales en condiciones extremas; en particular Sulfolobus islandicus utiliza chaperonas robustas que facilitan el plegamiento y la estabilización proteica. En este estudio nos centramos en transferir mecanismos de estabilización mediados por chaperoninas a la cellulasa CBHI, una enzima crítica en la degradación de celulosa para biocombustibles y otras industrias.

Metodología: El enfoque es multimodal e integrado.

Simulaciones de Dinámica Molecular y análisis estructural: Realizamos simulaciones MD de CBHI sola y en complejo con homólogos de HSP70/chaperoninas de S islandicus para identificar regiones vulnerables a la desnaturalización térmica y mapear la interfaz de unión. Cálculos de energía libre de interacción y análisis conformacional guiarán la mutagénesis dirigida hacia posiciones que aumenten la estabilidad. Las simulaciones se configuran con parámetros y protocolos reproducibles para permitir validación experimental.

Análisis de secuencias impulsado por inteligencia artificial: Se emplea un clasificador de aprendizaje automático tipo random forest entrenado con más de 10 000 secuencias de organismos extremófilos y mesófilos, integrando características como conservación de residuos, propensión a estructuras secundarias y propiedades fisicoquímicas de aminoácidos. Este clasificador predice el efecto de sustituciones puntuales sobre la estabilidad en el contexto de la secuencia, reduciendo drásticamente el espacio experimental a evaluar. La construcción del dataset incluye fuentes públicas de secuencias y puntuaciones de conservación para garantizar diversidad y representatividad.

Evolución dirigida con propagación de errores: Las mutaciones inspiradas en los resultados MD y priorizadas por el clasificador se introducen en CBHI mediante PCR con baja fidelidad para generar una biblioteca de variantes. Las variantes se criban en ensayos de alto rendimiento usando sustratos cromogénicos para cuantificar actividad mientras se somete a estrés térmico. El proceso iterativo de mutagénesis y selección permite mejorar simultáneamente estabilidad y función.

Validación y caracterización: Las variantes seleccionadas se caracterizan con Calorimetría Diferencial de Barrido para determinar temperaturas de fusión Tm, Dicroísmo Circular para evaluar cambios en estructura secundaria y mutagénesis dirigida para confirmar residuos clave identificados por MD. Estas técnicas proporcionan medidas cuantitativas de estabilidad y de la conservación de la actividad catalítica.

Modelo matemático y marco de optimización: Formalizamos el problema como multiobjetivo. Sea x el vector de mutaciones introducidas en CBHI. Definimos delta Tm(x) = Tm(x) menos Tm de la variante silvestre y delta Activity(x) = Activity(x) menos Activity de la variante silvestre. La función objetivo F(x) combina ambas métricas con factores de ponderación w1 y w2 que reflejan la importancia relativa de estabilidad frente a actividad, ajustados mediante optimización bayesiana según requisitos industriales. El objetivo es minimizar F(x) = w1 por negativo de delta Tm(x) más w2 por negativo de delta Activity(x) de forma que se maximicen simultáneamente Tm y actividad. La exploración del espacio de mutaciones se realiza con un algoritmo genético implementado sobre bibliotecas de optimización evolutiva, guiado por datos MD y predicciones del clasificador para acelerar la convergencia. Parámetros de poblaciones, tasas de mutación y cruce se calibran según buenas prácticas para equilibrar exploración y explotación.

Resultados esperados e impacto: Esperamos incrementos de termoestabilidad de entre 10 y 20 por ciento en CBHI manteniendo actividad comparable. Beneficios previstos: reducción de costes de proceso por menor dosificación enzimática, posibilidad de operar a temperaturas más altas acelerando tasas de reacción, y menor desperdicio enzimático con impacto ambiental positivo. Académicamente, el trabajo profundiza en mecanismos de estabilización mediados por chaperonas y ofrece un marco transferible a otras enzimas industriales en sectores alimentario, farmacéutico y químico. La proyección económica para la industria de biocombustibles de celulosa puede ser significativa y la metodología es escalable.

Resultados preliminares y direcciones futuras: Simulaciones iniciales han identificado residuos clave en la interfaz entre CBHI y HSP70. Modelos de aprendizaje automático tempranos mostraron una precisión cercana al 82 en la clasificación de mutaciones estabilizadoras. Trabajos futuros integrarán arquitecturas de aprendizaje profundo, incluidas redes neuronales gráficas, para modelar plegamiento y acoplamiento coevolutivo entre enzima y chaperonina, y explorarán análogos artificiales de chaperoninas para mejorar plegamiento in vitro.

Verificación y robustez: La estrategia incluye verificación en múltiples niveles: concordancia entre predicciones MD y resultados experimentales de Tm, validación cruzada del clasificador ML y confirmación mediante mutagénesis dirigida de residuos estabilizantes. Análisis estadístico riguroso y ensayos replicados asegurarán la reproducibilidad.

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Conclusión: La convergencia de dinámica molecular, aprendizaje automático y evolución dirigida, inspirada en mecanismos de chaperoninas arqueales termofílicas, constituye una estrategia potente para diseñar enzimas industriales más resistentes. Combinado con software a medida, soluciones cloud y capacidades de inteligencia artificial y ciberseguridad de Q2BSTUDIO, este enfoque es una vía práctica y escalable para llevar biocatalizadores robustos al mercado, mejorando la eficiencia y sostenibilidad de procesos industriales.

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